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如何高效进行免疫荧光染色?
ibidi / 2020-05-26

本应用介绍了使用 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片培养,固定和染色贴壁细胞的简单方案。在此示例中,我们培养了人内皮细胞,用 paraformaldehyde 固定了它们,并对 F-actin 细胞骨架和表达α- 微管蛋白的微管进行了染色。细胞核用 DAPI 复染。

该应用四个主要步骤:

在本应用中,使用了以下材料:

材料

制造商

目录编号

µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat

伊比迪

81816

胡韦克

各种

各种

4%paraformaldehyde

西格玛奥德里奇

HT5011

0.1%Triton®X-100(在 PBS 中稀释)

阿尔法·埃萨(Alfa Aesar)

A16046

1% 牛血清白蛋白(在 PBS 中稀释)

西格玛奥德里奇

A1470

LifeAct-TagGFP2 蛋白

伊比迪

60112

单克隆抗 α-Tubulin 抗体,小鼠

西格玛奥德里奇

T5168

抗小鼠 IgG-Atto594

西格玛奥德里奇

76085

具有 DAPI 的 ibidi 安装介质

伊比迪

50011

可选:ibidi 浸油

伊比迪

50101

  荧光显微镜(倒置),带有合适的滤光片组

1. 播种

· 在无菌条件下打开 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat(#81816)的包装,并将其放在 µ-Slide 机架(ibidi#80003)上。

· 准备细胞悬液(1 x 105 细胞/ ml),并在 µ-Slide 18 孔载玻片每个孔中加入 100 µl。

· 用提供的盖子盖上腔室。

· 在潮湿的细胞培养箱(37°C,5%CO2)中培养过夜。对于更长的细胞培养,我们建议几天后进行中等程度的交换。

2. 固定,渗透和封闭

· 使用细胞培养抽吸装置从孔中抽吸细胞培养基。

· 用 Dulbecco PBS 冲洗细胞,方法是将 100 µl 缓慢加入每个孔。

· 用约 100 µl 4%paraformaldehyde 固定细胞 20 分钟。

· 用 PBS 冲洗细胞两次,方法是将 100 µl 缓慢加入每个孔中。

· 除去液体,并在 PBS 中加入约 100 µl 的 0.1%Triton®X-100。孵育 10 分钟。

· 用 PBS 洗涤细胞,缓慢将 100 µl 加入每个孔中。

· 除去液体,并在 PBS 中加入 100 µl 1%BSA 封闭溶液。孵育 20 分钟。

· 用 PBS 洗涤细胞,缓慢将 100 µl 加入每个孔中。

3. 染色

· 准备您的染色和抗体溶液。

· 使用细胞培养抽吸装置从孔中除去液体。

· 将 100μl 用 PBS 稀释的一抗(抗-Tubulin 1:1000)稀释到每个孔中,并在 4°C 下孵育过夜。

· 用 PBS 洗涤细胞一次,持续 10 分钟。

· 将在 PBS 中稀释的 100 µl 二级抗体混合物(抗小鼠 IgG-Atto594 1:500 和 LifeAct-TagGFP2 蛋白 30 µg / ml)稀释到每个孔中,并在室温下于黑暗中孵育 3 小时。

· 用 PBS 洗涤细胞两次,每次 10 分钟。

· 吸出 PBS,并在每个孔中加入约 100 µl 含 DAPI 的 ibidi 封固剂。使用滴管瓶滴加安装介质。

4. 显微镜观察

· 在荧光显微镜下用合适的滤光片组观察细胞,并可选择用 ibidi 浸油(#50101)观察细胞。

· (可选)覆盖图像以创建合并图像。

5. 结果

接种在 µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat 中,物镜 60x,油浸后 24 小时后的 HUVEC(人脐静脉内皮细胞)。

绿色:F-肌动蛋白(LifeAct-TagGFP2 蛋白)

红色:微管蛋白(单克隆抗 α-Tubulin 抗体,小鼠+抗小鼠 IgG-Atto594)蓝色:核仁(使用具有 DAPI 的 ibidi Mounting Medium 进行 DAPI 染色)

在本应用中使用的 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片带有 18 个孔的小室盖玻片,用于细胞培养,免疫荧光和高端显微镜检查,它具有以下特点:

  • 多合一 18 孔腔载玻片,用的细胞数量少,试剂量少的经济高效实验
  • 显微镜载玻片非常适合通过最高光学质量的 1.5 号聚合物盖玻片底部进行高分辨率成像
  • 适用于各种显微镜技术(例如 DIC,宽场荧光,共聚焦显微镜,双光子显微镜,FRAP,FRET,FLIM和  LSFM)的细胞培养室


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