本应用介绍了使用 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片培养,固定和染色贴壁细胞的简单方案。在此示例中,我们培养了人内皮细胞,用 paraformaldehyde 固定了它们,并对 F-actin 细胞骨架和表达α- 微管蛋白的微管进行了染色。细胞核用 DAPI 复染。
该应用四个主要步骤:
在本应用中,使用了以下材料:
材料 |
制造商 |
目录编号 |
µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat |
伊比迪 |
81816 |
胡韦克 |
各种 |
各种 |
4%paraformaldehyde |
西格玛奥德里奇 |
HT5011 |
0.1%Triton®X-100(在 PBS 中稀释) |
阿尔法·埃萨(Alfa Aesar) |
A16046 |
1% 牛血清白蛋白(在 PBS 中稀释) |
西格玛奥德里奇 |
A1470 |
LifeAct-TagGFP2 蛋白 |
伊比迪 |
60112 |
单克隆抗 α-Tubulin 抗体,小鼠 |
西格玛奥德里奇 |
T5168 |
抗小鼠 IgG-Atto594 |
西格玛奥德里奇 |
76085 |
具有 DAPI 的 ibidi 安装介质 |
伊比迪 |
50011 |
可选:ibidi 浸油 |
伊比迪 |
50101 |
荧光显微镜(倒置),带有合适的滤光片组
1. 播种
· 在无菌条件下打开 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat(#81816)的包装,并将其放在 µ-Slide 机架(ibidi#80003)上。
· 准备细胞悬液(1 x 105 细胞/ ml),并在 µ-Slide 18 孔载玻片每个孔中加入 100 µl。
· 用提供的盖子盖上腔室。
· 在潮湿的细胞培养箱(37°C,5%CO2)中培养过夜。对于更长的细胞培养,我们建议几天后进行中等程度的交换。
· 使用细胞培养抽吸装置从孔中抽吸细胞培养基。
· 用 Dulbecco PBS 冲洗细胞,方法是将 100 µl 缓慢加入每个孔。
· 用约 100 µl 4%paraformaldehyde 固定细胞 20 分钟。
· 用 PBS 冲洗细胞两次,方法是将 100 µl 缓慢加入每个孔中。
· 除去液体,并在 PBS 中加入约 100 µl 的 0.1%Triton®X-100。孵育 10 分钟。
· 用 PBS 洗涤细胞,缓慢将 100 µl 加入每个孔中。
· 除去液体,并在 PBS 中加入 100 µl 1%BSA 封闭溶液。孵育 20 分钟。
· 用 PBS 洗涤细胞,缓慢将 100 µl 加入每个孔中。
· 准备您的染色和抗体溶液。
· 使用细胞培养抽吸装置从孔中除去液体。
· 将 100μl 用 PBS 稀释的一抗(抗-Tubulin 1:1000)稀释到每个孔中,并在 4°C 下孵育过夜。
· 用 PBS 洗涤细胞一次,持续 10 分钟。
· 将在 PBS 中稀释的 100 µl 二级抗体混合物(抗小鼠 IgG-Atto594 1:500 和 LifeAct-TagGFP2 蛋白 30 µg / ml)稀释到每个孔中,并在室温下于黑暗中孵育 3 小时。
· 用 PBS 洗涤细胞两次,每次 10 分钟。
· 吸出 PBS,并在每个孔中加入约 100 µl 含 DAPI 的 ibidi 封固剂。使用滴管瓶滴加安装介质。
4. 显微镜观察
· 在荧光显微镜下用合适的滤光片组观察细胞,并可选择用 ibidi 浸油(#50101)观察细胞。
· (可选)覆盖图像以创建合并图像。
5. 结果
接种在 µ-Slide 18 孔载玻片 ibiTreat 中,物镜 60x,油浸后 24 小时后的 HUVEC(人脐静脉内皮细胞)。
绿色:F-肌动蛋白(LifeAct-TagGFP2 蛋白)
红色:微管蛋白(单克隆抗 α-Tubulin 抗体,小鼠+抗小鼠 IgG-Atto594)蓝色:核仁(使用具有 DAPI 的 ibidi Mounting Medium 进行 DAPI 染色)
在本应用中使用的 ibidi µ-Slide 18 孔载玻片带有 18 个孔的小室盖玻片,用于细胞培养,免疫荧光和高端显微镜检查,它具有以下特点: