活细胞显微成像系统硬件触发方案的简要探讨

广州科适特科学仪器有限公司

一、显微镜各组件工作方式及为什么需要硬件触发？

广州科适特科学仪器有限公司在为客户提供显微镜及配件和服务过程中，经常有客户问到为什么显微镜需要做硬件触发？为了帮助客户更好的理解显微镜，我们整理了此文简单探讨。活细胞成像实验现在需要比以往更高的速度和更多的数据处理量。本文以尼康显微镜为例简单介绍通过硬件之间的直接信号触发显微成像设备。这样可以尽量地减少延迟，使设备同步并减少光对样品的照射。本文简要说明了尼康的NIS-Elements触发工作流程和工作方式，并详细介绍了其对于常见的时间序列采集中的好处。

显微镜成像系统是由几个硬件设备一起工作的组合。这些设备可能包括XY电动平台，Z轴聚焦驱动器，压电快速XY或Z驱动器，电动滤光片轮，光源（落射荧光和透射光）以及检测器。软件控制着这些设备的移动，因此在理想的环境中，检测器的曝光时间将成为实验速度的限制因素。
然而，大部分情况下，当使用软件控制设备移动时，无法达到理想的速度。许多具有不同固有速度的设备速度偏差使得显微镜软件必须通过一系列命令和回调来调解设备移动和图像捕获。结果，由于与软件的交互而产生了速度延迟。对于单个图像或简单的实验，延迟可能不那么明显，但是对于大数据实验，这种延迟对总体采集时间的影响可能会非常显著。
主机上的定时时钟频率最终决定显微镜的性能。因此，在同一台计算机上管理的多个进程很容易影响主机的高精度定时。

二、解决方案举例：通过NIS-Elements中的直接硬件触发来绕过软件延迟

当今大多数高性能检测器和外围设备都具有I / O（输入和输出）端口，用于直接电压信号的设备力学控制。例如，大多数光源具有直接的模拟和TTL（晶体管-晶体管逻辑电路）控制连接器，以及通常的串行通信。但是，商用显微镜软件包通常使用串行通信，该通信仅依赖于计算机时钟和软件控制。
尼康的NIS-Elements软件已经使用I/O连接已有相当长的一段时间了，并且会继续扩展其功能。该软件通过使用这些功能提供硬件触发功能。直接I/O电压信号的连接来实现快速驱动设备。设备控制与信号采集的同步至关重要。所有这些信号都是通过数字采集接口（DAQ）进行管理，以实现灵活性和便利性。 National Instruments数据采集设备（NIDAQ）上的定时时钟也比主机PC的定时时钟精确得多。为此，NIS-Elements支持National Instruments NIDAQmx系列设备。

图1通过直接的硬件触发，曝光信号以及相关设备的运动情况。该图显示了通过硬件触发光源，电动滤光轮和Z轴电动马达控制进行五通道信号采集的示例。 NIDAQ监测相机的曝光。 NIDAQ输出信号控制激发波长和持续时间，以使它们出现在透射（Tx）光或UV，蓝色，绿色或红色激发波长的时间流逝的后续帧中。曝光后还会显示发射（Em）滤光轮的位置，由于该设备的速度较慢，因此移动持续时间以红色表示。请注意，在检测器没有曝光触发时候，各个部件移动的时钟是同步的。最后，压电Z轴马达的位置跟曝光信号以及帧数相关，因此仅在完成一帧循环后才发生移动。

三．NIS-Elements如何执行硬件触发

通过NIDAQ监测到检测器曝光信号，并且连接好了外围硬件设备，硬件触发变得很容易理解了。一个定义多维实验的参数，然后NIS-Elements设置运行的顺序。一旦检测器开始工作，NIDAQ便会在两次曝光之间移动硬件设备并在曝光期间控制照明。在这种安排下，检测器将主控（Master）信号提供给NIDAQ，而NIDAQ协调所有其他外设的时钟和顺序（图1）。

NIDAQ可以进行精确的照明控制，只有在检测器曝光时才打开光源，而在照相机不进行曝光时（包括在检测器的读出时间内），光源会立即关闭。此外，NIDAQ甚至可以自定义曝光应在照明内激活多长时间，并且还可以对照明进行脉冲控制。这种控制减少了照明的持续时间，从而将时间保持在绝对最短的时间。对于LED或激光源，开/关时间在数十微秒的范围内。例如目前应用最多的CoolLED公司的pE-4000和pE-300光源切换时间可以达到20微秒。
硬件触发还可通过同时启动所有设备来有效执行多设备控制。并行触发提高了整体速度，因为没有顺序执行一个设备移动另一个设备的操作。设备的定时和速度也是已知的，因此NIS-Elements甚至可以以重叠（“实时”）采集模式运行的检测器的读出时间内控制设备移动，在这种模式下，检测器始终在运行。

四、简单经济的快速触发解决方案-CoolLED “Sequence Runner”

2020年10月14日，英国Andover–全球LED显微镜照明专家CoolLED推出了其新型8通道pE-800 LED照明系统用于宽视野荧光显微镜。 pE-800具有八个可独立控制的LED和闪电般的快速TTL切换功能，以最低的总拥有成本提供了最高质量的数据。独特的8通道Sequence Runner结合使用时，照明序列可以通过相机中的单个TTL触发，从而将手动显微镜转变为价格合理且功能强大的八通道自动成像系统。

8通道Sequence Runner,通过单个TTL输入（例如从摄像头TTL输出）通过全局TTL快速控制和同步切换选定的LED及其辐照度，切换速度<7 µs。需要较少的电子硬件。NIS Elements已经集成Sequence Runner，如果没有配置NiDAQ板，这将是一个非常经济高效的解决方案。

五、强大的硬件触发的显微镜主机架

徕卡DMi8或者奥林巴斯IX83及尼康公司的Ti2-E等倒置显微镜扩大了硬件触发的潜力，Ti2-E倒置显微镜支架上的所有电动组件都具有硬件触发或减少延迟的优势。Ti2-E的关键功能包括本地直接连接检测器的功能（即使没有NIDAQ）：显微镜本身知道曝光何时完成并立即执行下一个设备的动作。这提供了一些令很好的功能，例如非常快速的自动对焦功能。包含NIDAQ也可以通过直接硬件触发来启动显微镜硬件，从而允许定制的触发配置包括显微镜硬件和第三方设备。例如，透射光和落射荧光光源，二向色镜，压电Z轴驱动马达和发射滤片转盘都可以一起控制。

尼康显微镜系统如果需要实现硬件触发功能，需要配置NIS-Elements AR，C和HC软件包，NIDAQ和用于触发设备控制的插件。NIS-Elements软件可以管理越来越多的硬件触发的设备类型（表1），包括CoolLED光源，驱动马达，照明模块，传感器和信号发生器。所有这些设备都可以用于基本的多维采集实验，但也可以用于刺激/激活实验，高容量获取实验以及自定义实验流程（例如光源照明顺序），使用户以完全灵活地控制触发的设备控件，实验顺序和模式。

表1| NIS Elements硬件触发的设备类别

借助尼康的NI触发盒（NI-BB）（图2）等外围设备即可轻松进行硬件触发的设备配置，NI触发盒设备包括一个NIDAQ和一个专用分线盒，带有预定义的连接器和电缆，用于XYZ设备，荧光光源，透射光的LED，滤光片转轮，激光单元，光刺激设备和Ti2-E触发的显微镜支架。 NIS-Elements设备管理器可以很方便的根据所使用的连接器将NIDAQ的资源分配给每个连接的设备。检测器（最多三个）也可以轻松连接到控制箱。

图2 |尼康NI-BB套件通过预定义的连接器电缆直接连接各种硬件设备，以便直接触发控制。简化了外围设备和NIDAQ的软件设置。

六、小结

尼康的NIS-Elements硬件触发是一种功能强大而有效的方案，可尽量地减少样品在光源下的照射时间，减少或消除两次激发之间的时间延迟，并大大减少整个实验时间。表2中显示了一些典型的实验示例，比较了相同硬件和设置。区别是在Ti2-E倒置显微镜上使用直接硬件触发和显微镜曝光终端感应功能的软触发。

表2 |实验持续时间与常见硬件和实验参数的变化比较

硬件触发可显著缩短整体实验时间。在大多数这些示例中，相机的曝光时间长于相机的读取时间。最后一行是一个比较，其相机曝光时间与其读数相同时间，并且摄像头能够在完全重叠（100％占空比）模式下运行。

在采购显微镜系统时，可以考虑将要使用的外围设备。具有I/O触发功能的设备（即使最初不使用）也提供了内置的升级途径。用于硬件触发的NI-Elements软件控件花费很小，而且配置简单。采用硬件触发功能的实验设计和控制既合理又简化，用户只需触摸一下按钮，即可保存和调用触发的设备配置。

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