类器官、细胞球与3D细胞培养在疾病模型与再生医学研究中展现出了巨大的应用潜力。然而，手动统计仍然是大多数实验室进行3D细胞研究时所采用的常规手段，这种方法不仅耗费大量时间与人力，在统计3D结构尺寸时也容易受到人为因素干扰而造成误差。本期的小C讲堂，将为大家带来Corning细胞计数仪(Corning Cat. No. 6749)与类器官计数软件(Corning Cat. No. 6749-OC)自动化计数解决方案，可以快速精准地获取3D细胞球的数量与尺寸数据。

细胞球的建立

MRC5细胞在康宁 Elplasia® 球面底6孔板（Corning Cat. No. 4440）中培养成球。培养板底部有多个超低吸附表面的微腔，支持每孔形成多达2885个尺寸一致的细胞球。在本研究中我们设置了3组细胞浓度，使每个微腔中MRC5细胞的起始平均分布各有50、100和200个（每孔起始细胞数分别为1.44 x 106、2.89 x 106或 5.77 x 106个）用于形成不同尺寸（定义为小、中和大）的细胞球。如图1所示，细胞接种后在37°C 和 5% CO2 条件下培养2天，即可在微腔中形成细胞球。

图1. 经过两天的培养后，康宁 Elplasia® 板中形成的尺寸一致的细胞球

细胞球计数

细胞球悬液制备：将两个孔中获得的细胞球（约5000个）转入15 mL 离心管中，以 200 x g 离心 3 分钟，弃掉上清并用 100 μL 的 PBS重悬。

Corning细胞计数仪（Corning Cat. No. 6749）与类器官计数软件（Corning Cat. No. 6749-OC）一起用于自动计算球体的浓度和大小。将20 μL 细胞球悬液加入到3D counting chamber (Corning Cat. No. 480201)中，置于载物台上进行分析。3D counting chamber深度为0.2 mm，适配直径20– 200 μm的细胞球体结构。康宁自动化解决方案为用户提供了两种基于图像算法的操作选项，以分别应对不规则的3D结构和规则的球形结构，此处示例为球形结构图像计算方案。

手动统计是将 10 μL细胞球悬液加入 384 孔高内涵成像微孔板（Corning Cat. No. 4681）中，在显微镜下仔细观察、计数，并计算细胞球浓度。

实验结果

Corning细胞计数仪的图像分析算法能够准确识别不同尺寸的细胞球（图2）。

图2. 使用Corning细胞计数仪自动计数与手动计数的典型图。（A-C）每个微腔50个细胞形成的细胞球；（D-F）每个微腔100个细胞形成的细胞球；（G-I）每个微腔200个细胞形成的细胞球；（A, D, G）计数前细胞球的明场图像；（B, E, H）使用图像分析算法分析细胞球的明场图像；（C, F, I）显微镜下 384 孔微孔板中细胞球的明场图像

相较于手动计数法，Corning细胞计数仪计算得出的细胞球浓度更加接近于理论值（图3），而两种方法测量出的细胞球的直径没有显著差异（图4）。

图3. 细胞球浓度统计结果

图4. 细胞球直径统计结果

结论

Corning细胞计数仪类器官计数软件可以快速且精准地统计类器官或细胞球等3D结构的数量与尺寸，可以完美代替传统的手工计数方法，既省时省力，又节约实验耗材。

Corning细胞计数仪类器官计数软件所提供的图像分析方法，能在应用范围内准确识别出不同尺寸的不规则类器官或规则的细胞球，从而为使用者直接提供类器官的数据。