荧光显微镜是目前使用频率很高的常用实验室仪器。如果优化从光源到样品表面的照明是实验室经常碰到的问题。广州科适特科学仪器有限公司在给客户服务过程中，根据客户反馈和参考相关文献，简要总结如何优化显微镜荧光光源。当来自显微镜荧光光源在通往显微镜的样品表面可能出现问题时，可以在以下部位查找可能的故障原因。

显微镜荧光光源与倒置荧光显微镜的连接。虹色标记的位置1-5对应于后续表格中用于测量的光路中的位置。

近年来，越来越多的LED光源被用于荧光显微镜成像。这些LED光源的设计克服了汞灯和金属卤化物弧光灯的局限性，可提供令人优越的性能，远远超过了早期的照明光源。LED显微镜荧光光源具有高信噪比（SNR）和高分辨率，增强的灵敏度和稳定性特点。可为荧光显微镜成像提供高质量的实验数据，同时具有更长的使用寿命和更低的维护成本。

但是，要实现LED光源的这些优点，必须将照明器的输出有效的传送到显微镜的样品表面。我们可以研究一下显微镜荧光光源是如何传递到显微镜样品表面的。光路分析不仅可以用于优化照明效果，还可以用于解决照明中出现的问题。

显微镜光源光路分析

当我们发现显微镜样品平面的荧光激发亮度不够，很容易就认为光源有问题，光强不够。但通常不一定正确。因为实际上，光路的所有中间组件都可能影响最终的样品表面照明。解决这个问题需要考虑所有将照明器输出传输到显微镜的光学组件的情况（请参考下图），这些配件最终都会影响整个显微镜的通光率。

该表对从显微镜荧光光源到显微镜样品表面的光通量进行了逐步分析。使用10倍物镜（位置5A）在样品平面上测得的光通量大概15–50 mW / mm²，基本在宽场荧光显微镜的需求范围内（1–100 mW / mm²）。下图显示了用来测试的光源到Nikon Ti显微镜样品表的光通量。

对于荧光显微镜应用，光源提供的辐照度在各波长下是不一样的。这是因为荧光发射光强度取决于可用于荧光团吸收的光子数。对于相同的辐照度水平，光子数量随波长增加。因此，在其它条件不变的情况下，375 nm激发光下产生一定荧光强度所需的辐照度是750 nm（2×375 nm）所需的辐照度的两倍。因此，在显微镜光源中通常红色光谱区域具有较低的辐射通量水平（635/22 nm；请参阅表的最右列）。

尽管表中所示的辐射通量水平对于常规的宽视野荧光显微镜来说是足够使用的，但确实存在改进的机会。此类改进针对两个主要应用需求。首先，要在较短的时间间隔内获取更多图像而又不影响信噪比，则需要来自光源的较高辐射度和较短的相机曝光时间。第二，许多用于提高宽视野荧光显微镜的空间分辨率的技术会增加光学滤片。由滤片引起的损耗必须通过增加光源的输出来补偿。

改进方法探讨

我们参考表中光路，简要地研究实现这些改进的方法。

1. 激光光源：与本文举例使用的LED荧光光源不同，采用固态二极管激光光源来提高输出光功率。

2. 液体光导管。液体光导可以减少显微镜荧光光源引起显微镜振动。它也可以使光源可以放在远离显微镜的位置，避免操作空间太拥挤。但是，液体光导管会降低显微镜荧光光源输出，损耗35％到50％的光强。可以选择较大直径（例如5mm光导管代替3mm）的液体光导管提高辐照度，这通常需要重新设计显微镜光路以将增加的光强传播到样品平面。

3. 准直镜：与基于消色差透镜的传统设计相比，采用复眼透镜的准直仪可提供出色的光通量和空间均匀性。

4. 物镜：在落射荧光显微镜中，荧光强度与物镜数值孔径（NA）相关，物镜的数值孔径越大，荧光强度也增加。因此，选择大数值孔径的物镜，同时具有足够的工作距离能够获得更好的荧光效果。

总体来说，荧光显微镜的照明光源技术不断在发展。传统的弧光灯有很多缺点，包括它们含有有毒的汞蒸气。LED光源由于光强的不断改进，已经能够满足大部分荧光成像的要求。但是，按照上面介绍的分析步骤进行操作，将有助于显微镜用户理解光源与显微镜是如何一起工作的，并有助于找到光源及成像问题的原因。

参考文献

1. D. Grünwald, S. M. Shenoy, S. Burke, and R. H. Singer, Nat. Protoc., 3, 1809–1814 (2008).

2. D. Dormann, PLoS One, 14, e0214659 (2019).

3. B. Van Giel, Y. Meuret, and H. Thienpont, Opt. Eng., 46, 043001 (2007).

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