钙是影响多种细胞过程的重要信使，包括细胞迁移、交流和对刺激物或异物作出反应的能力。由于其在细胞功能中的重要性，细胞内的钙（称为细胞内钙）受到高度调节。钙主要储存在细胞器内，例如内质网和线粒体，并根据特定信号释放。这种严格的调节使细胞内钙成为了解细胞功能和信号动力学的绝佳工具。

钙：细胞过程的多功能指示剂

有几种细胞内钙的荧光指示剂可用于研究细胞功能。这些指标使研究人员能够检查伤口愈合、传染病、药物治疗等过程中的细胞反应。

在我们的实验室中，我们使用钙信号作为读数来了解病毒在感染过程中利用宿主信号反应的能力，并剖析所涉及的信号通路。为此，我们利用含有荧光钙指示剂的细胞活细胞成像，其中荧光的增加表明细胞内钙的增加。

轮状病毒感染的非洲绿猴肾细胞 (MA104) 的活细胞成像。MA104 细胞，以绿色显示，表达钙指示剂 GCaMP6s，其中绿色增加表示细胞内钙增加。在这个活体细胞成像视频中，轮状病毒感染的细胞呈红色——Hyser 实验室此前曾报道，在轮状病毒感染期间，轮状病毒会导致受感染细胞中的细胞内钙增加，随后激活邻近细胞中的特定信号通路，从而引起未感染细胞的细胞内钙信号 (Chang-Graham et al., 2020)。

钙指示剂的种类及应用：

钙指示剂主要分为两大类：化学指示剂（即染料）和基因编码的钙指示剂（即钙指示剂被编码到细胞系、动物模型或系统中）。钙指示剂已用于使用显微镜、高通量筛选和流式细胞术进行的体内和体外工作。然而，我们将专注于使用显微镜在体外可视化和量化钙信号。用于活细胞成像实验的钙指示剂类型取决于预期的细胞系、成像长度以及定性或定量数据的预期结果等因素。

1. 预期细胞系：

对于原代细胞系，直接的方法是使用荧光染料（化学指示剂），其中荧光钙指示剂被简单地添加到培养的细胞中，并可以在孵育期后成像。这些染料也是首次实验收集初步数据的极好方法。使用荧光染料时的一个重要提示是在添加之前和之后彻底清洗细胞，因为染料会导致高背景荧光，使得在显微镜和活体成像期间更难以正确聚焦细胞。

与基因编码的钙指示剂相比，荧光染料通常更亮、更稳定。然而，染料通常不如遗传传感器特异，并且可以具有更高的背景荧光。在活细胞成像中，荧光染料（包括 Fura-2AM、Fluo-4AM、Indo 1AM 等）可以有效地进行短期活细胞成像。一个潜在的警告是，在某些细胞中，细胞可能会保留染料或无法正确加载到某些细胞类型或亚群中。此外，随着时间的推移，细胞倾向于抽出染料。虽然添加阴离子转运蛋白抑制剂可以防止细胞泵出染料，但这些抑制剂可能对某些细胞类型具有细胞毒性，如果使用其他治疗方法评估钙信号的变化，可能会使情况复杂化。钙染料的一个重要考虑因素是使用抑制剂还是激动剂。抑制剂和激动剂也可能影响钙染料反映类似于天然组织中的表达的能力。

在用 ADP 进行激动剂治疗期间，人肠道类器官单层的实时、短期成像。这些有机体单层以绿色表达钙指示剂 GCaMP6s。ADP 是一种已知的激动剂，用于在细胞中引发细胞内钙信号传导。激动剂治疗是测试治疗剂量反应的极好方法。

2. 成像长度

时机就是一切。对于活细胞成像，时间长度和间隔是需要牢记的重要参数。成像过程中的主要问题是光漂白和光毒性。应避免连续应用激发光，重要的是选择足够强的曝光时间和光功率来检测钙信号，但不要过强，以免对细胞造成损害。成像的长度将取决于实验。对于测试激动剂或细胞反应，这通常是 5-20 分钟的较短成像运行，每 1-2 秒捕获一次图像。对于研究伤口修复或病毒感染期间钙信号传导的实验，我们会在 18-20 小时内成像，每分钟捕捉一次图像。

轮状病毒感染的非洲绿猴肾细胞 (MA104) 的活细胞成像。MA104 细胞，以绿色显示，表达钙指示剂 GCaMP6s，其中绿色增加表示细胞内钙增加。在这个活细胞成像视频中，轮状病毒感染的细胞呈红色——Hyser 实验室此前曾报道，在轮状病毒感染期间，轮状病毒会导致受感染细胞中的细胞内钙增加，随后激活邻近细胞中的特定信号通路，从而引起未感染细胞的细胞内钙信号。

钙成像LED光源

pE-340 fura和pE-800 fura提供了最全面的钙成像系统，强大而高效的 LED 提供 340-635 nm 的光谱覆盖范围，适用于所有流行的钙指示剂、pH 指示剂、视蛋白以及从 Fura-2 到 Cy5 的日常荧光荧光团。通过 USB、TTL 或模拟实现对所有八个通道的单独控制，以便轻松地将每个 LED 与选定的钙指示剂或荧光团组匹配。与激光不同，LED 更宽的光谱输出可以通过使用滤光片进行细化，以激发一系列染料，从而扩大的覆盖范围。使用新的 LED 照明光源，可以将更少的 Fura-2 染料加载到细胞中，同时仍保持相同的测量钙浓度和良好的信噪比。由于染料毒性降低，所需染料的减少不仅提高了细胞活力，而且还降低了每次实验的成本,通过波长切换和滤光片定制波长输出的能力意味着实验不再受光源的限制，即使在未来需求发生变化或新染料出现时也是如此。

活细胞成像的技巧

考虑要使用的细胞系很重要。为了研究钙动力学（或其他细胞信号），使用形成为单层的细胞系将确保感兴趣的区域将保持聚焦以捕获信号动力学以获得最佳视频质量和干净的量化。对于涉及细胞间通讯和钙动力学的实验，细胞系汇合度也是一个重要的考虑因素。为了获得最佳质量的成像，选择合适的载玻片非常重要。有些细胞培养物更喜欢玻璃而不是光学级塑料载玻片，因此最好测试腔室载玻片。我们为我们的细胞系使用ibiTreat  µ-Slide 8 Well高腔盖玻片。

µ-Slide 8 Well high（货号80806）

对于活细胞成像，重要的是以允许形成融合的单层但不会导致细胞过度拥挤和结块的密度对细胞进行铺板。最后一个技巧是在成像过程中使用合适的介质。许多传统细胞培养基含有酚红，会导致高背景荧光。这使得在成像过程中很难将真实信号与背景噪声分开。因此，用 PBS 清洗细胞并用无酚红培养基或用于活细胞成像的市售培养基替换培养基非常重要。

毒胡萝卜素治疗前后非洲绿猴肾细胞 (MA104) 的活体短期成像。MA104 细胞，以绿色显示，表达钙指示剂 GCaMP6s，其中绿色增加表示细胞内钙增加。毒胡萝卜素是一种众所周知的肌细胞/内质网 Ca2+-ATP 酶抑制剂（这对于从胞质溶胶中螯合钙很重要）。通过这种抑制作用，毒胡萝卜素诱导内质网应激，并可导致源自内质网的细胞内钙增加。

参考：

Chang-Graham AL, Perry JL, Engevik MA, Engevik KA, Scribano FJ, Gebert JT, Danhof HA, Nelson JC, Kellen JS, Strtak AC, Sastri NP, Estes MK, Britton RA, Versalovic J, Hyser JM. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 2020 Nov 20;370(6519):eabc3621. doi: 10.1126/science.abc3621.